產品名稱：碧云天beyotime酵母質粒小量抽提試劑盒(D0029)現貨供應

產品貨號：D0029

產品品牌：碧云天

產品簡介：

碧云天酵母質粒小量抽提試劑盒是一種使用破壁酶(Lyticase)消化去除酵母細胞壁，然后采用一種新型的酵母質粒純化柱實現從酵母細胞中進行小量質粒快速抽提的試劑盒。

每個質粒純化柱可以結合的質粒量的上限約為20微克。質粒DNA的產量依賴于酵母攜帶質粒的拷貝數，酵母菌株以及生長條件。通常酵母質粒的拷貝數較低，1.5-5ml培養過夜的酵母抽提獲得的質粒DNA量約為1-3微克左右。高拷貝酵母質粒抽提時的得率會大大提高。抽提所得質粒的量與酵母培養濃度、質粒拷貝數、酵母品系等因素有關。

使用本試劑盒抽提得到的酵母質粒DNA可用于各種常規分子生物學實驗，如轉化、PCR、基于PCR的突變、體外轉錄、酶切、測序、文庫篩選等。

使用說明：

1.取培養過夜的酵母1.5毫升，5000g離心1分鐘收集酵母沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3毫升培養過夜的酵母。再在離心機快速離心一下(5000g離心1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。

通常酵母宜30°C培養過夜(16-24小時左右)。建議5000g(～5000-6000rpm)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于后續加入溶液I后充分重懸沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升酵母液并重復上述的離心操作，然后直接倒掉上清，再在離心機快速離心一下(5000g 1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。殘余液體必須吸盡，否則可能會干擾后續的酶解反應。如果酵母密度明顯偏低，可考慮使用更多酵母液，再重復上述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超過5ml。過量的酵母會導致后續的酶解和堿裂解不充分。

2.每管加入100微升酶解緩沖液，重懸酵母沉淀。確保沉淀wan全散開，無可見酵母團塊。

可以通過劇烈Vortex來重懸沉淀。

3.加入20微升配制好的Lyticase溶液，充分混勻，30℃水平搖床200-250rpm孵育0.5-1小時。

注意：根據酵母菌株和酵母細胞數量的不同，酶解的孵育時間可進行適當調整。當酵母用量較大時，酶解的孵育時間需延長。孵育時間延長到2-3小時通常不會對質粒抽提帶來負面影響。

4.1500g (～3000-4000rpm)離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

直接倒掉上清，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。也可在直接倒掉上清后再在離心機內甩一下，用移液器吸盡殘留液體。不同離心機因離心半價的不同g和rpm的換算值有所不同。

5.每管加入250微升溶液I，重懸酵母沉淀。確保沉淀wan全散開，無可見酵母團塊。

確認溶液I中已經添加了RNase A。由于此時酵母細胞壁已經去除，重懸操作要溫和，不宜劇烈振蕩，否則會容易導致基因組DNA的污染。但同時必須保證沉淀充分散開，即必須確保酵母細胞充分分散到溶液中。

6.每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體wan全裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致最終所得質粒被基因組DNA污染。遇到有少量團塊或絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。

7.每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。

切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致最終所得質粒的質量下降。

8.最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。

離心后會產生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。

9.將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。最高速離心30-60秒，倒棄收集管內液體。

質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。

10.在質粒純化柱內加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體。

加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。

11.最高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇wan全揮發。

注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能che底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。

12.將質粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內柱面上，放置1分鐘。

溶液V需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V沾在管壁上，一定要震動管子，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q級純水替代溶液V，但是水的pH應不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。

13. 最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度酵母質粒。

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